腸道微生物與宿主之間互惠共生,密不可分,定植在宿主體內(nèi)的共生微生物可以通過(guò)多種機(jī)制影響宿主生理與病理生理功能。其中,膽汁酸是溝通宿主與腸道微生物的關(guān)鍵信使分子。初級(jí)膽汁酸,如:膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CDCA)在人體肝臟中合成而來(lái),并經(jīng)由膽囊進(jìn)入腸道,被腸道微生物代謝為脫氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)等次級(jí)膽汁酸。膽汁酸可以通過(guò)調(diào)控法尼醇X受體(FXR)、膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)、維生素D受體(VDR)等宿主受體,在宿主糖脂代謝、免疫應(yīng)答等多個(gè)生理與病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因而受到了研究人員的廣泛關(guān)注。然而,目前腸道微生物對(duì)膽汁酸的修飾類(lèi)型還有待挖掘,不同膽汁酸與疾病調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確,菌群膽汁酸代謝的生物合成通路解析仍是該領(lǐng)域的重點(diǎn)與難點(diǎn)。
該研究構(gòu)建了基于點(diǎn)擊化學(xué)富集策略結(jié)合非靶向代謝組學(xué)方法的次級(jí)膽汁酸挖掘體系,發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)膽汁酸的全新修飾類(lèi)型—3-?;揎?;通過(guò)分離培養(yǎng)建構(gòu)腸道菌株庫(kù)及大規(guī)模篩選,研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)是3-琥珀酰膽酸(3-sucCA)主要的腸道菌來(lái)源;通過(guò)基于活性的蛋白追蹤純化策略,研究團(tuán)隊(duì)挖掘出3-sucCA合成酶——“BAS-suc”。最后,臨床隊(duì)列提示3-sucCA與代謝相關(guān)脂肪性肝炎(MASH)進(jìn)程呈顯著的負(fù)相關(guān)性。研究團(tuán)隊(duì)深入解析了3-sucCA在代謝性疾病的保護(hù)作用與分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其通過(guò)菌群重塑—促進(jìn)益生菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的生長(zhǎng),改善腸屏障損傷,降低慢性低水平炎癥,從而逆轉(zhuǎn)小鼠的MASH表型。該研究為未來(lái)臨床治療代謝相關(guān)脂肪性肝炎(MASH)等代謝性疾病的潛在藥物開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)研究,為菌源膽汁酸的生物合成研究提供了新的方向,同時(shí)也為調(diào)控疾病的腸道菌源酶挖掘研究提供了新范式。
該研究建立了一套菌源膽汁酸挖掘體系,利用該挖掘體系,研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了一系列包含?;男滦途茨懼?。通過(guò)大規(guī)模糞便菌群發(fā)酵液分離與化學(xué)合成比對(duì),研究團(tuán)隊(duì)在膽酸所包含的3個(gè)可發(fā)生?;磻?yīng)的羥基位點(diǎn)(3位、7位、12位)中,確認(rèn)所有的新型菌源膽汁酸其?;恢枚及l(fā)生在3位上。最后,研究團(tuán)隊(duì)在菌群、小鼠、人群三個(gè)維度系統(tǒng)地檢測(cè)了新型膽汁酸的豐度及流行率,這些?;懼釓V泛存在,可能存在一定的生理作用。在評(píng)估新型膽汁酸的豐度及流行率過(guò)程中,3-琥珀酰膽酸(3-sucCA)在健康志愿者糞便樣本中表現(xiàn)出了最高的豐度與流行率。為探索3-sucCA的主要腸道菌來(lái)源,研究團(tuán)隊(duì)收集了3-sucCA豐度最高的健康志愿者的糞便樣本,通過(guò)分離培養(yǎng)建構(gòu)腸道菌株庫(kù)、大規(guī)模菌株篩選、小鼠定植檢測(cè)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)在體外或體內(nèi)都存在3-sucCA合成能力。
為探索單形擬桿菌中負(fù)責(zé)3-sucCA生物合成的關(guān)鍵酶,研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)大腸桿菌過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了單形擬桿菌中所有的16種注釋為?;D(zhuǎn)移酶的基因,然而這些候選基因都沒(méi)有產(chǎn)3-sucCA的活性。接下來(lái),研究團(tuán)隊(duì)以單形擬桿菌裂解液粗酶反應(yīng)為基礎(chǔ),通過(guò)基于活性的蛋白純化與鑒定方法,逐步根據(jù)裂解液>80%硫酸銨蛋白沉淀> 疏水相互作用色譜(HIC)> 離子交換色譜(IEC)層層純化,最終利用蛋白質(zhì)譜分析揭示出118個(gè)候選蛋白。團(tuán)隊(duì)通過(guò)異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)將以上118個(gè)蛋白全部進(jìn)行一一驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)只有過(guò)表達(dá)一個(gè)被注釋為β-內(nèi)酰胺酶的蛋白A7UYF6可以使大腸桿菌獲得產(chǎn)3-sucCA的能力。進(jìn)一步地,研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的厭氧菌基因敲除實(shí)驗(yàn)、近緣同屬菌株過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)、以及純酶體外酶促實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該酶負(fù)責(zé)3-sucCA的生物合成,并將該酶命名為“BAS-suc”。
通過(guò)質(zhì)譜成像技術(shù)(DESI-MSI)、體外生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定以及一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):3-sucCA作為一種局限于腸腔的代謝物,可以通過(guò)重塑腸道菌群,尤其是促進(jìn)嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的生長(zhǎng),來(lái)改善MAFLD疾病中顯著受損的腸道屏障,增加黏膜厚度及杯狀細(xì)胞數(shù)量,進(jìn)而阻礙MAFLD疾病進(jìn)程。而敲除菌株的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明:?jiǎn)涡螖M桿菌對(duì)MAFLD的改善作用完全依賴(lài)3-sucCA的生成。以上結(jié)果在臨床隊(duì)列中也得到驗(yàn)證,研究團(tuán)隊(duì)招募了55名經(jīng)活檢的MAFLD病人與21名對(duì)照人群隊(duì)列,發(fā)現(xiàn)糞便中3-sucCA含量隨著MAFLD疾病進(jìn)程逐步降低,且與疾病相關(guān)指(ALT/AST)等呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果揭示了3-sucCA作為新型菌源膽汁酸通過(guò)菌群互作改善MAFLD的新范式。
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